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嗜热脂肪芽孢杆菌

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嗜热脂肪芽孢杆菌
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嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)属嗜热性需氧芽孢杆菌,但兼有厌氧的特性,细菌繁殖体G兰氏染色阳性呈紫色,细菌芽胞孔雀绿着色。嗜热脂肪芽孢杆菌比较容易识别且对人体没有危害性,一般作为空间消毒的指示生物。

由中国国家标准化管理委员会2015年发布的《湿热灭菌用生物指示剂》(GB 18281.3-2015)于2017年01月01日正式实施,正式将嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)改称为嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)。

主要特性

嗜热脂肪地芽孢杆菌营养细胞呈长杆状、圆端,多数为单个、少数成对或链状排列,细胞宽 0. 6 ~ 1.μm、长 2. 0 ~ 3.5μm,细胞壁为革兰阳性结构,但染色可在阳性和阴性之间变化。芽孢呈椭圆或柱状、端生或次端生,孢囊膨胀或不膨胀,无伴孢晶体形成。最佳生长温度为 56 ~ 60℃,最高生长温度为 65 ~ 75℃,最低生长温度为 30 ~ 45℃,需氧或兼性厌氧,利用葡萄糖产酸不产气。现中国工业微生物菌种保藏管理中心( CICC) 收藏菌株为嗜热脂肪地芽孢杆菌编号为 CICC 10267 株,即 ATCC 7953 株,其在营养琼脂上56℃培养 24h 的菌落形态呈浅黄色,表面粗糙湿润,边缘不整齐 ; 该菌株在 Cook等产孢培养基上 56℃培养 24 h,取菌苔涂片经芽孢染色法染色后,1 000倍光学显微镜下观察到多数仍为染成红色的繁殖体与部分已经形成染成蓝色的芽孢形态 ; 在产孢培养基上 56℃培养 5 d,镜下观察到 90% 以上为已经形成染成蓝色的芽孢,只有少数是染成红色的繁殖体。

分类学演变历程

1917 年 Smith 等人在实验室分离出嗜热脂肪地芽孢杆菌,1920 年 Donk 将其归类于芽孢杆菌属( Bacillus) ,并命名为嗜热脂肪芽孢杆菌( Bacillus stearothermophilus)。传统分类上对于芽孢杆菌属的分类标准较为宽松,导致该属细菌在生理、基因等方面存在很大差异。近年来随着分类学研究的不断深入,DNA G + C mol% 、16S rDNA 序列分析、核酸杂交等分类技术的不断发展,芽孢杆菌属细菌的分类也得到更改与修正。 1949 年,Gordon 和 Smith对收集到的 216 株细菌进行分类研究,其中 160 株被归类于两个嗜热菌种: 嗜热脂肪芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌( B. coagulans) ,他们认为这两个菌种各自代表了一组需氧、嗜热、形成芽孢的细菌。

1991 年 Ash等对 51 种芽孢杆菌属菌种的 16S rDNA 完整序列进行了分析,根据分析结果将它们分成 5 个不同的系统发育类群,并认为这 5 个类群明显代表着不同的菌属; 同时提出芽孢杆菌属菌种在遗传方面相当混乱,需对其进行大量的分类学修正。Ash 等的研究成果标志着对芽孢杆菌属进行重新分类的开始,此后从 1992 年至 1999 年陆续从芽孢杆菌属中独立出 8 个新属。

2001 年,Nazina等对芽孢杆菌属的嗜热菌组群进行了生理特性对比研究,在此基础上,又对其进行脂肪酸分析、 DNA - DNA 杂交、16S rDNA 序列分析等一系列分类学研究。研究认为它们是一组系统发育相近、生理和形态相似的细菌,可以组成新的菌属,并就此提出了一个新的菌属名称: 地芽孢杆菌属( Geobacillus) 。Nazina 等将包括嗜热脂肪芽孢杆菌在内的 6 种菌从芽孢杆菌属分离出来,与最近发现的新种一起归类为地芽孢杆菌属,该属已得到国际上的公认。地芽孢杆菌属中现已确切描述并命名的共有 21 个种及亚种,模式种为嗜热脂肪地芽孢杆菌,模式菌株为 DSM 22T( = ATCC 12980 T) 。

权威菌种保藏机构如 ATCC 和 DSMZ,以及国际权威标准和药典等,已经将 Bacillus stearothermophilus 更名为Geobacillus stearothermophilus,国内仍称为嗜热脂肪芽孢杆菌( Bacillus stearothermophilus) 。  

鉴定方法

对于嗜热脂肪地芽孢杆菌的鉴定,传统分类中根据形态特征、生理生化特性、生态特性等指标进行鉴定的方法耗时耗力,因此基于分子生物学的鉴定方法不断发展。2005 年, Daniel R. Zeigler报道了利用 recN 基因序列相似性分析鉴定地芽孢杆菌属菌种的研究。研究表明,对于属、种及亚种水平的分类,recN 基因序列分析的鉴定分辨率接近甚至比 16S rDNA 序列分析更高,但突变饱和度限制了 recN 基因序列对更高层次分类的应用,然而 recN 基因序列分析对地芽孢杆菌属菌株种的鉴定具有重要作用。2007 年,Nomeda Kuisiene等报道了利用 AluI 限制性内切 16S rDNA 扩增片段来鉴定嗜热脂肪地芽孢杆菌的方法。使用限制酶 AluI 将 16S rDNA 酶切,嗜热脂肪地芽孢杆菌的 16S rDNA 酶切电泳图将呈现出特殊条带: 162bp 条带的出现和 76bp 与 86bp 条带的缺失。同年,Nomeda Kuisiene等又报道,以 16S - 23S rDNA 内转录间隔区序列为靶基因设计特异性引物GEOBAC,以其 PCR 产物来鉴定地芽孢杆菌属菌种。这些快速而准确的鉴定方法为嗜热脂肪地芽孢杆菌及地芽孢杆菌属其它菌种的研究与应用奠定了基础。  

应用

生物指示剂标准菌

嗜热脂肪地芽孢杆菌( ATCC 7953) 所产芽孢无致病性、无热原、无毒,且对压力蒸汽的抵抗力在大多数微生物中最强,因此被欧洲药典、美国药典、日本药典等作为热力灭菌生物指示剂的标准菌株收录。我国卫生部也将该菌株作为压力蒸汽灭菌效果评价的标准检测菌株列入《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》( GB 15981 - 1995) 和《消毒技术规范》( 2002 版) ; 同时,国家质量监督检验检疫总局也将其作为湿热灭菌用生物指示物列入《医疗保健产品灭菌生物指示物》( GB 18281.3 - 2000) 标准中。嗜热脂肪地芽孢杆菌( ATCC 7953) 用于制备生物指示剂最重要的技术指标就是对一定灭菌因子有确定的抗力。 2002 年版《消毒技术规范》中明确规定嗜热脂肪地芽孢杆菌( ATCC 7953) 芽孢灭菌生物指示剂在 121℃ ± 0. 5℃ 条件下的抗力指标: 存活时间≥3.9min,杀灭时间≤19min,D 值为1. 3min - 1. 9min。然而同一菌株培养出的芽孢,其抗力也可能不同,此与培养方法和营养成分有关。Beaman等对该菌株粗糙型和光滑型芽孢 100℃条件下的 D 值进行了测定,分别为 124 min 和579 min,因此制备生物指示剂必须严格确定菌株与菌落形态。此外,培养基成分不但对芽孢生成率有显著影响,对芽孢的热抗力也有明显作用,如芽孢形成培养基中钙离子浓度增加,可使芽孢的热抗力增加。芽孢的形成温度对芽孢的热抗力也有一定影响,Cook 等的研究表明,在 50℃、55℃、60℃ 条件下形成的芽孢,培养温度越高抗热能力越强。综上所述,生物指示剂的热抗力受多种因素影响,故对其制备条件应予严格控制; 同时对生物指示剂产品,必须使用符合标准的抗力检测器对其抗力性能进行严格测试。

鲜乳中抗生素残留检验

长期以来,抗生素在奶牛饲养业中应用广泛,如为预防或治疗疾病,常在饲料中添加含有一定比例抗生素的饲料添加剂,这对于长期饮用牛奶的消费者来说无疑是等于长期服用小剂量的抗生素,因此必须严格控制抗生素最高残留限量。国标 CB/T 4789. 27 - 2008 中规定了两种检测鲜乳中抗生素残留的方法 - 嗜热链球菌抑制法和嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法。嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法中所用菌种为嗜热脂肪芽孢杆菌卡利德变种( Bacillus stearothermophilus var. calidol- actis),该菌种在国际权威的保藏机构 DSMZ 中已更名为嗜热脂肪地芽孢杆菌。该菌种对青霉素等抗生素非常敏感,生长速度快,此外其还有一个重要特性是最佳生长温度范围较高,仅有少数微生物可在该温度范围内生长,因此杂菌影响结果的可能性很小。 

耐热性

罐头食品经过加热处理后一般残留的细菌为嗜热菌及其芽孢。嗜热脂肪芽孢杆菌是一种兼性厌氧菌,嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢是耐热性最强的芽孢之一,通常作为验证湿热灭菌程序的生物指示剂,同时也是造成罐头食品腐败变质的主要微生物之一。芽孢的耐热性除了与芽孢种类有关,还与所处的环境如酸碱度,水分活度,无机盐浓度等有着紧密的关系。

食品组分与芽孢耐热性

食品罐内杀菌热加工概念已有很长的历史大致始于1920年,随后将近一个世纪的发展。主要围绕长时间的高温热处理杀灭导致腐败和危害健康的微生物以期延长产品的货架期。而对于食品的要求已经超出了对于安全性和货架期的要求,更追求感官舒适性,高质量,营养健康以及方便性。因此杀菌工艺的趋势在于保证安全性的同时最小程度的减小对食品组分的破坏。经过众多科学研究发现,不同的食品组分对于微生物的耐热性有着不同的影响。悬浮液的pH,缓冲剂,NaCl和阳离子等都会影响细菌或芽孢的耐热性,但是研究的结论却不尽相同。如IciekJ利用数学模型研究表明在降低pH以及在有少量盐存在的情况下,能提高芽孢的激活和坏;PeriagoPM得到了类似的结论,且pH与NaCl对嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的D值都有显著性的作用8]:而GulinC等人研究酸土环酯芽孢杆菌芽孢在苹果汁中不同pH,不同固形物浓度下的耐热性时发现酸土环酯芽孢杆菌芽孢耐热性几乎没有影响。BriggA等人又发现,NaCI浓度从2%增加到8%时能降低嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的耐热性却对枯草芽孢杆菌芽孢没有影响101。LopezM认为0.06%的NaCI就能有效降低芽孢耐热性,而且在各种缓冲液中,只有磷酸盐缓冲液浓度增大,D值增大,其他缓冲液几乎没有影响。在有机物中,通常情况下我们认为蛋白质(如血清白蛋白)和碳水化合物(如蔗糖)对孢子耐热性有促进作用。 

食品添加剂对芽孢耐热性的影响

加热基质中如果有杀菌剂或抑制剂存在时会降低芽孢耐热性。早在上世纪四十年代有人提出来少量的杀菌剂可提高在低温下的杀菌效应。Pederson提出22ppm的二氧化硫可以使果汁巴氏杀菌的温度降低5.5℃。MichenerHD研究了650种物质对梭状芽孢杆菌芽孢P.A3679耐热性的影响,除抗氧化剂之外,影响较大的物质有氧化乙烯,环氧二丁烷,过氧化氢,甲醛,胍十二烷,溴化物,溴化物和蒜油等。而研究发现枯草菌素(subilin)的浓度在0.002-0.02ppm,乳酸链球菌素(Nisin)的浓度在0.004-0.04ppm时,P.A3679耐热性表现的非常敏感。LewisJC也考察了67种抗菌素,却发现绝大多数并没有显著效果,而乳酸链球菌素和枯草菌素却有比较好的效果,能降低P.A3679的D值50%左右。关于抑菌剂对芽孢耐热性的影响机理方面的探索,报道的比较少且深度也比较浅。MichenerHD]研究发现经过热处理的梭状芽孢杆菌芽孢比未经过热处理的芽孢对枯草菌素更为敏感,并推断枯草菌素可能粘附在芽孢表面,在后复活培养萌芽后会抑制微生物的生长,而受热处理后的芽孢更加容易萌芽,因此更容易受枯草菌素的影响。而对于Nisin降低嗜热脂肪芽孢杆菌的作用机理的探索过程中,LeonL利用胰岛素和Nisin的作用指出Nisin事实上也是影响芽孢后复活培养时的萌芽。而对于抑菌剂对芽孢耐热性的影响现阶段主要有三个截然不同的观点:1.后期复活时阻止和延长腐败菌的生长。2.杀死微生物细胞或芽孢。3.对热处理时起到协同作用,降低耐热性。MaisnierS在牛奶中加入Nisin,研究Nisin与适度的加热对李斯特菌的办同破坏作用,加入Nisin后能大大提高对李斯特菌的破坏作用,例如不加入Nisin时,在54℃ 下降低103需要77min,加入25IU/mL的Nisin后,只需要16min。然而NaimF却发现单独作用时Nisin即使浓度达到750IU/mL,对产芽孢梭状芽孢杆菌耐热性并无明显影响。而在pH3.5,Nisin浓度2000IU/mL,90℃时却对产芽孢梭状芽孢杆菌耐热性有显著的协同降低作用,D90从19.6min下降到1.17min。

山梨酸钾是国际粮农组织和卫生组织推荐的高效安全的防腐保鲜剂,广泛应用于食品、饮料、化妆品等行业,能有效地抑制霉菌,酵母菌和好氧性细菌的活性,还能防止肉毒杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌等有害微生物的生长和繁殖,从而达到有效地延长食品的保存时间,并保持原有食品的风味。其防腐效果是同类产品苯甲酸钠的5-10倍。关于山梨酸钾对嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢耐热性的研究还比较少,MariaF和Cerruttip分别研究了低水分活度,低pH下时,山梨酸钾对Z.bili和Saccharomycescerevisiae的耐热性有着良好的降低作用。乳化剂是能改善(减小)乳化体中各种构成相之间的表面张力,形成均匀分散体或乳化体的物质,是-类具有亲水基和疏水基的表面活性剂,在食品中有着广泛的应用。乳化剂有一定的抑菌作用,常以表面涂层的方法用于食品和水果抑菌保鲜。具有抗菌作用的蔗糖酯对微生物具有广泛的抑制作用,一般而言,对革兰氏阳性菌,特别是孢子形成菌的抑制作用大于革兰氏阴性菌,其作用机制主要是抑菌而非杀菌。


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