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乳酸菌素的检测及应用

2014/10/15 中广微生物
    乳酸菌素是一类由乳酸菌在代谢过程中由核糖体合成的一类有抑菌活性的多肽或前肽。乳酸菌素的抑菌活性仅限于与其亲缘关系较近的种,且一般乳酸菌对其自身产生的乳酸菌素具有一定的抗性。传统的多肽抗生素由细胞多酶复合体催化形成,无相关的结构基因编码,而乳酸菌素由结构基因编码,可通过现有的基因工程手段加以改造。L. A. Rogers等于1928年发现乳酸链球菌的代谢产物能抑制乳酸菌,此后这种代谢产物经鉴定为细菌素。乳酸菌素能抑制甚至杀死食品中大多数革兰氏阳性腐败菌和致病菌,只有少数乳酸菌素对革兰氏阴性菌有抑制作用。乳酸菌素由于其无毒副作用、无残留、无抗药性及对环境无污染的优点,将有可能减少甚至取代抗生素的使用,因此有广泛的应用前景。本研究将对乳酸菌素的分类、检测及应用进行综述。
1.乳酸菌素的分类
1.1 根据种属分类
    根据乳酸菌素产生的种属的不同,可将乳酸菌素分为以下六类:(1)乳球菌属细菌素:包括乳球菌素、乳链球菌素、乳链菌肽、双球菌素等。其中对乳链菌肽(Nisin)的研究最为透彻;(2)片球菌属细菌素:这个属的细菌素热稳定性较好,只能抑制革兰氏阳性菌,主要由乳酸片球菌、啤酒片球菌和戊糖片球菌产生。(3)乳杆菌属细菌素:包括戊糖乳杆菌素、植物乳杆菌素、瑞士乳杆菌素和Lactacin B等;(4)明串珠菌属细菌素:包括Leuconostoc UAL187等;(5)肉食杆菌细菌属:包括Carnocin UI49等。(6)其他乳酸菌素:如嗜热链球菌的代谢产物对霉菌有一定的抑制作用。
1.2 根据分子结构及热敏感性分类
    根据其分子结构及热敏感性,可以把乳酸菌素分为以下几类:(1)羊毛硫类细菌素,其分子内活性部位含有羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸等非编码氨基酸。该类细菌素又可分为两个亚类,一类具有延伸的螺旋状结构,带正电荷,可在细胞膜上形成电位依赖性孔道,此类型中的代表是Nisin。最初Nisin被认为是一种表面活性剂,是由于其中的两个脱水氨基酸可以与细菌细胞中酶的疏基发生反应,因此产生抑菌活性。目前则认为是由于Nisin能在细胞膜表面形成电压依赖性孔道,从而破坏细菌细胞膜,Nisin还可以抑制细菌细胞壁中肽聚糖的合成,使细胞膜内磷脂化合物的合成受阻,导致细胞内物质外泄,从而使细菌细胞受损。另一种亚类则是球状的,且不带电荷,能抑制细菌细胞壁合成。(2)小分子热稳定肽:热稳定性较好,其分子量小于10 kD,是一类疏水的具有膜活性的肽。此类乳酸菌素的抑菌机理主要是细菌素可以吸附在细胞膜上形成孔道,增加其通透性,从而导致细胞内各种离子的渗漏和能量物质消耗,使膜内外离子失衡,从而导致质子驱动力的耗散,导致细胞死亡。(3)大分子热不稳定肽:是一类分子量大于10 kD,热稳定性较差,抑菌谱较窄的肽类。一般在100 ℃或更低温度下,30 min内即失活。其中包括Lacticin A、Lacticin B和Caseicin 80等。目前对此类细菌素研究不是太多。(4)复合型细菌素:这类细菌素含有蛋白以及碳水化合物或内脂基团,组成复杂大分子复合物才具有活性。如Bacilysocin等。
2.乳酸菌素的分离纯化及检测
2.1 乳酸菌素的分离纯化
    由于乳酸菌素分子量较小、带较多的正电荷且疏水性较强,所以常用硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、快速制备液相色谱等方法对其进行分离纯化。Nes等[1]提出一套方法来进行乳酸菌素的分离纯化:硫酸铵沉淀阳离子交换层析疏水层析反相高效液相色谱,此方法适用于Nisin和Lactoccin A等的纯化。Koji Yamazaki等通过硫酸铵沉淀、凝胶过滤,然后通过阳离子交换层析,可以纯化得到乳酸菌素,其纯度为7%。还有其他研究都通过使用吸附法、膜分离法、泡沫分离法以及免疫磁珠分离法来纯化乳酸菌素。在由Aplin和Barrett公司的专利中,他们通过盐析,再溶解,然后再沉淀的方式,最后将浓缩物进行喷雾干燥。
    在实际的操作过程中,则需要根据所具备的实验条件和实验要求选择不同的纯化方法,如大规模生产则选用低成本、回收率高的方法;实验室研究对纯度和活性较高,则需要联合使用多种纯化技术并尽量使用较温和的条件,以免降低乳酸菌素的生物活性。
2.2 乳酸菌素的鉴定
    常用的测定乳酸菌素活性的方法包括琼脂扩散法、滤纸片法、点种法、浊度分析法、绿色荧光蛋白测定法、ATP生物发光测定法及微量滴定法,还有基于反相高效液相色谱、阳离子交换色谱和毛细管区带电泳的分析方法。不过要排除乳等有机酸以及过氧化氢等代谢物的干扰。为研究乳酸菌素的形成机制,快速对其进行定性及定量分析,必须建立能消除有机酸和过氧化氢等代谢产物影响的快速简便的分析方法。何宁等[2]对杯碟法检测乳酸菌素活性的主要影响因素进行了研究,结果表明,在含有指示菌106 CFU/mL的YPN培养基中加入1%(V/V)吐温80,0.002%(m/V)次甲基兰,并将其pH调为5.0为最佳检测条件。刘长建等[3]用高效液相色谱检测乳酸菌素产生菌的发酵液,并以乳酸菌素标准品作为对照,初步筛选出乳酸菌素产生菌。何宁等[2]关于乳酸菌素对指示菌的作用方式进行了研究,他们发现乳酸菌素在极低浓度时能刺激指示菌的生长;达到一定浓度之后,开始表现出一定的抑菌作用,且随着其浓度的增加其抑菌活性有所提高,甚至完全抑制指示菌的生长,取检测平板上透明圈区域的琼脂块于肉汤培养基中培养,指示菌仍能生长,这说明乳酸菌素对于指示菌呈现抑制作用。根据现有的实验条件选择合适的乳酸菌素鉴定方法,如果只需要初步定性检测,则可选择杯碟法或琼脂扩散法;如果需要精确定量,则需要用反相高效液相色谱进行精确定量分析。
3 ·乳酸菌素的应用
    由于传统的抗生素会产生一定的抗药性,且从法律的角度考虑,抗生素通常不允许应用于食品中。用于生产食品添加剂的细菌应该不产生任何毒素或抗生素。因此,乳酸菌素有望逐步取代抗生素,广泛应用于我们生活中的各个领域。
3.1 在食品防腐保藏中的应用
    乳酸菌作为发酵剂发酵生产乳制品有着安全且久远的历史。其中Nisin应用最为广泛,它对许多革兰氏阳性菌有明显的抑制作用。许多研究者也曾在食品中加入一些乳酸菌素作为防腐添加剂。Reviriegoc等[4]在奶酪制品中加入了片球菌素PA-1和能产Nisin的乳酸链球菌,PA-1加能协同增加Nisin对单增李斯特菌的抑菌活性。
    肉类制品在储存过程中容易滋生病原体和腐败有机体,其中革兰氏阴性菌是主要腐败菌群,而化学防腐剂的添加对人体有一定的毒性,因此,安全、无毒且无残留的乳酸菌素正逐渐受到大家的亲睐。Ghalri等[5]研究发现乳酸弯曲杆菌素与精油能协同抑制冷藏猪肉中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌的生长。宋萌等[6]研究发现,在牛肉中添加1 000 IU/g的Nisin和0.6%的麝香精油,可以使冷藏肉中的李斯特菌的浓度由500 CFU/g左右下降至2 CFU/g。
    新鲜蔬菜中易污染食物病原体,应不宜高温处理,在低温下也较难操作,且其中带有大肠杆菌污染物。Allendea等[7]将4种细菌素(Nisin Z、Lacticin 481、Plantaricin C和Coagulin)添加至用薄膜包装的莴笋中,可明显抑制李斯特菌的生长。冷藏条件下可以保存7 d。
    乳酸链球菌素Nisin已经被广泛应用于啤酒及其它酒类产品,以防止酒类酸败,同时还能抑制乳酸菌的生长繁殖。
    Franklin等[8]观察研究发现,用涂有乳酸菌素Nisin的包装纸包装热狗,包装纸表面李斯特菌的数量比用普通包装纸表面的李斯特菌数量明显减少。Scannell等把乳酸菌素Lacficin 3147涂在包装纸上,在3个月内可以有效抑制乳酸杆菌的生长。Jin等[9]采用涂有Nisin的聚乳酸材料包装橙汁等饮品,他们发现Nisin能有效抑制单增李斯特菌、大肠杆菌和沙门氏菌的生长。这说明将高分子材料与乳酸菌素结合起来制作包装材料,将在保藏食品方面有广阔的应用前景。
3.2 在医药方面的应用
    乳酸菌素能增加机体产生更多的特异性和非特异性免疫物质,并启动吞噬细胞酶的相关活性,还能有选择性地杀灭肠道内致病菌,以促进体内益生素的生成,从而调节机体的免疫功能。乳酸菌素能刺激肠道产生更多的IgA,从而增强机体的细胞免疫和体液免疫。尤其是乳酸菌中的双歧杆菌是一种重要的生理性细菌,这种细菌能增加人体免疫力并延缓衰老,还能抑制人体内致病微生物的生长,从而促进人体健康。此外,还有研究表明,乳酸菌素在妇科用药方面也有一定的应用前景。在阴道用制剂中,乳酸菌的代谢产物乳酸和过氧化氢等物质能保持阴道内正常酸性环境。乳酸菌可调节阴道中菌群平衡,抑制并消除致病细菌的生长,乳酸菌素还可用于菌群紊乱引起的细菌性阴道病的治疗。
    乳酸菌素对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性致病菌均有一定的抑制作用,所以可用于治疗因消化不良引起的腹胀、腹泻、肠胃炎等,而且乳酸菌素还能调节肠道菌群平衡;另有研究表明,乳酸菌素对痤疮和粉刺的形成也有一定的治疗效果;含乳酸菌素的食物和漱口液能抑制口腔内病原菌的生长,因此乳酸菌素在预防龋齿方面有广阔的应用前景。
3.3 在饲料方面的应用
    迄今为止,乳酸菌素较多地以饲料添加剂的形式应用于饲料领域。无害微生物生成的蛋白质或多肽可以抑制禽类小肠中的弯曲杆菌和部分病原性细菌的生长。Vederas等[10]将乳酸菌素Lacticin 3147加入到奶牛乳头封口处,可以有效防止革兰氏阳性菌感染,因此可代替乳头栓。
    乳酸菌素添加到饲料中,既可以抑制病原微生物的传播,也可以防止沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌污染,同时还可以调节动物肠道菌群平衡。而且乳酸菌素对动物无毒副作用、热稳定性好、且无抗原性,还可以被消化道内的蛋白酶降解生成可被人体利用的氨基酸。因此乳酸菌素作为饲料添加剂的应用不会在动物体内引起不良反应,还可较好地保持饲料的营养价值和风味。
4.结论与展望
4.1 结论
    对乳酸菌素的分类、作用机理、分析检测及应用进行了综述,乳酸菌素是一类具有广谱抑菌能力的多肽,且由于其安全无毒副作用的特性,已经广泛地应用于食品保藏、医药和饲料等领域。
4.2 展望
    过去十几年来,人们对于乳酸菌素的研究主要集中在菌株筛选、活性检测及相关生物学特性的研究,关于分离纯化及应用的研究还不是太多。但随着生物化学、免疫学技术和分子生物学的不断进步,人们对于乳酸菌素的研究越来越集中于分子生物学方面,未来的研究重点主要集中在以下几个方面:1) 高产广谱乳酸菌素生产菌株的筛选;2) 运用基因工程技术对乳酸菌素生产菌株进行改良,使其具备不同的特性,提高其对环境的适应能力;3) 利用分子学相关技术提高乳酸菌素的产量;4) 研究乳酸菌素等细菌素的抑菌机制,并研究乳酸菌素结构与功能间的关系,用以研究乳酸菌素的免疫机理;5) 利用基因重组技术改造能产乳酸菌素的细菌,以提高其乳酸菌素产量,并扩大其抑菌范围;6) 运用蛋白质工程相关的技术改造细菌素的关键作用部位,以提高其抑菌性能;7) 由于乳酸菌素分子量不是太大,可以根据相关的生物信息学技术设计新型的乳酸菌素然后进行化学合成,以使其更好地应用于生活中的名个领域。
    乳酸菌素由于其广谱抑菌的特性,以及其安全、无毒、无残留、低免疫原性和降解产物可吸收利用的优点,未来将在食品、医药和饲料等领域有着越来越广泛的应用。
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